摘要


殺菌劑百菌清(CHT)因其高效、殺菌等優點在茶園中得到廣泛應用。據報道,反復施用CHT會抑制土壤硝化過程。然而,CHT對土壤反硝化和相關N2O排放的急性影響尚不清楚。本研究評估了硝酸鹽(NO3?)72℃高溫處理后茶園土壤的去除、反硝化基因豐度和反硝化酶活性。結果發現,將CHT從5 mg kg增加到25 mg kg?1抑制NO3?去除效率從74.6%提高到54.1%,但N2O排放量從23.1%增加到94.8%。用25 mg kg治療后?在CHT中,nirK、nirS和nosZ基因的豐度分別降低了31.6%、22.1%和50.7%。另外,電子傳遞系統活性(ETSA)值和三磷酸腺苷(ATP)含量的下降表明CHT對微生物代謝有抑制作用。酶活性研究進一步表明,硝酸還原酶(NAR)、亞硝酸鹽還原酶(NIR)和一氧化氮還原酶(NOR)活性的降低是CHT抑制反硝化作用的主要原因。此外,反硝化還原酶活性與細胞內代謝呈正相關,表明微生物代謝的減少也應是CHT對反硝化過程的抑制作用的原因??偟膩碚f,研究發現,土壤急性暴露于CHT可抑制反硝化過程并顯著增加N2O排放,這可能導致土壤氮循環破壞和全球變暖加劇。

1、引言


百菌清(CHT)由于其潛在的環境毒性,近幾十年來備受關注。CHT作為一種廣譜非系統殺菌劑,廣泛用于控制小麥、水稻、蔬菜、花生、茶葉等作物的病蟲害(張等,2014)。茶葉作為許多亞洲國家的重要經濟作物,需要定期施用CHT來控制茶樹病害(Gilho等人,2000)。CHT能牢固粘附在茶樹表面,并能抵抗雨水和水的侵蝕。作為一種中等持久性農藥,CHT在不同土壤中的半衰期(t1/2s)從三天到一個月不等(Hladik和Kuivila,2008;Singh等人,2002;Van Scoy和Tjeerdema,2014;Wu等人,2012)。由于其在農業中的廣泛應用,在水、沉積物和土壤中發現了CHT及其代謝產物(Hladik和Kuivila,2008;Putnam等人,2003)。


氮循環是全球生物地球化學循環的重要組成部分,與富營養化、水體酸化和溫室效應等一系列環境問題密切相關。作為氮循環的關鍵組成部分,反硝化可以減少硝酸鹽(NO3?)從陸地和水生環境到氮(N2)。特別是,脫氮過程中可能會產生一氧化二氮(N2O),這是因為其具有巨大的全球變暖潛力(比二氧化碳(CO2)高300倍)(IPCC,2006年)。先前的研究表明,CHT應用抑制了土壤微生物活性(Sigler和Turco,2002),抑制了土壤硝化過程(Kinney等人,2005),并降低了土壤氮循環的功能基因豐度(Zhang等人,2016)。例如,Kinney等人(2005)進行的一項研究表明,由于土壤硝化作用對CHT的高度敏感性,在土壤中添加CHT會減少N2O的產生。張等(2016)報道,重復施用CHT可能會對幾種氮循環基因的豐度產生顯著的負面影響,例如amoA、amoB和nosZ基因。此外,CHT可以在不同類型的土壤中以較高的添加速率顯著抑制硝化作用(Lang和Cai,2009)。盡管之前的研究已經表明CHT對硝化有負面影響,但CHT對反硝化的影響仍不確定。


脫氮需要從NO3開始一個連續的生物還原過程?至亞硝酸鹽(NO2?),一氧化氮(NO)、N2O和N2。為了完成這一過程,反硝化需要接受來自其他生物過程的電子,例如碳源代謝和電子傳輸系統(Zumft,1997)。電子由碳源代謝產生,并傳遞到電子傳輸系統。然后,它們將在反硝化還原過程中被消耗,該過程由硝酸還原酶(NAR)、亞硝酸鹽還原酶(NIR)、一氧化氮還原酶(NOR)和氧化亞氮還原酶(NOS)催化(Saggar等人,2013)。除了電子外,碳源代謝和電子傳遞鏈也可以產生ATP。作為細胞內能量轉移的貨幣單位,其水平與脫氮密切相關(Knowles,1980)。遺憾的是,目前尚不清楚反硝化的綜合分子機制,其涵蓋了廣泛的方法(即ETSA值、ATP含量和反硝化酶活性)。因此,土壤反硝化過程的全貌尚不清楚。


基于此,本研究旨在探討CHT施用對土壤反硝化的急性影響及其相關分子機制。作為試驗土壤,我們收集了中國江西省的茶園土壤。本研究的具體目標是:(1)研究NO3?不同CHT暴露濃度下的減少和N2O排放;(2)研究CHT施用后的反硝化還原酶活性、反硝化基因豐度和微生物群落;(3)評估CHT對電子傳遞鏈和微生物活性的急性影響;(4)了解反硝化過程與分子生物學指標之間的相關關系??紤]到之前關于CHT應用于土壤微生物活性的報道,我們假設:1)CHT應用可以抑制土壤反硝化過程;2)CHT通過影響反硝化酶活性來抑制反硝化;3)CHT施用后其他微生物活性的相關變化會影響土壤反硝化過程;ETSA值和ATP含量與反硝化酶活性密切相關。


2、材料和方法


2.1樣品和化學品


2017年7月7日,從中國江西省江西紅壤研究所(28°15′N,116°55′E)采集了5公斤茶園土壤樣本(0-20厘米深)。土壤在室溫下風干,通過2 mm篩網篩分以去除石塊和塑料碎屑,在室溫下儲存,然后在10小時內進行實驗。實驗前,部分樣品用于測定CHT殘留物和土壤理化性質。所有樣本均未檢測到CHT或其代謝物的濃度。表S1顯示了采樣土壤的選定物理化學性質。CHT(98%活性成分)購自中國阿拉丁科技公司。CHT標準溶液購自中國J&K Scientific。


2.2土壤急性暴露于CHT


土壤樣本暴露于CHT濃度范圍內(0、5、10和25 mg kg?1:分別為C0、C5、C10和C25),對應于推薦劑量(5 mg kg)?1),2倍劑量(10 mg kg?1)和5倍劑量(25 mg kg?1)(Teng等人,2017年)。簡言之,將80 g干茶園土壤放置在血清瓶中,用含有相同濃度NO3的10 mL溶液處理每一種土壤?-N(110 mg kg?1)和葡萄糖(5 mg g?1).溶解CHT配方并添加到土壤樣品中,以達到5、10和25 mg kg的目標濃度?1,并向一個瓶子中加入等量的蒸餾水作為對照。蒸餾水也被添加到每個瓶子中,以將最終土壤含水量保持在持水量的60%,這與土壤的原始狀態相似。為了維持厭氧條件,將氮氣注入蒸餾水中(30分鐘,30–40毫升/分鐘),以保持其最終氧化還原電位(ORP)=?300 mV和溶解氧(DO)分別為0.1 mg/L。用橡膠塞密封后,將含有土壤的血清瓶在28±1°C的恒溫下培養72小時,以測定NO3?,NO2號?將相當于2 g干土的銨(NH4+)與20 mL 2 M KCL混合,并在200 rpm下搖晃30分鐘(Miller等人,2008)。離心土壤溶液(4000 rpm,10分鐘),并通過0.45μm孔徑過濾器過濾懸浮液。然后,使用離子色譜ICS-600(美國Thermo Fisher Scientific)分析濾液。為了測定最終的N2O濃度,在培養結束時,用氣密注射器抽取每個瓶子的10毫升頂空樣品。使用配備電子捕獲檢測器的氣相色譜法(2010 plus,日本島津)分析氣體樣本(劉等人,2018)。根據測定的NO3?,NO2號?,土壤提取物中的NH4+和N2O濃度,NO3?,NO2號?,NH4+和N2O濃度轉換為mg N kg?1土壤。如Chaves等人(2008)所述,使用氣相色譜-質譜法(TQ8040,日本島津)測定CHT殘留物。支持信息中描述了細節提取和測量方法。


2.3反硝化酶活性的測定


本研究使用Zheng等人(2014b)報告的方法檢測了四種反硝化酶(NAR、NIR、NOR和NOS)的活性。簡言之,在72小時暴露后,使用磷酸鹽緩沖鹽緩沖液從5 g土壤樣品中提取反硝化酶,沖洗兩次,然后再懸浮在10 mL 0.1 M磷酸鹽緩沖鹽(PBS)溶液中,進行超聲處理(4°C,200 W)和離心處理(16000 rpm,10分鐘,4°C)。然后,將2 mL酶提取物添加到4 mL混合物中,該混合物根據先前報告的方法進行了修改(Zheng等人,2014b)。酶測定混合物(總體積4.0 mL)包括:100 mM PBS緩沖液、10 mM Na2S2O4和10 mM甲基紫精作為電子供體,以及2 mM電子受體(NO3)?和NO2?或NO和N2O)。培養30分鐘(保持在30°C)后,NO3?和NO2?通過分光光度法測量濃度(DR 5000,HACH,美國),并通過微傳感器(MMMMmeter,Unisense,Denmark)檢測液相中的N2O濃度(Zheng等人,2014a)。NAR和NIR活性計算為μmol NO2-N·g?1土壤·h?1,NOR和NOS活性計算為μmol N2O-N·g?1土壤·h?1.


2.4.ETSA和ATP的測定


在本研究中,通過將2-(新苯基)-3-(對硝基苯基)-5-苯基四氮唑氯化物(INT)還原為甲贊(INF)來測量土壤中細菌的ETSA值(Broberg,1985;Wan等人,2016)。簡而言之,在不同CHT濃度(C0、C5、C10和C25)下培養72小時后,在類似于酶提取過程的過程中收獲細菌。然后,向收獲的溶液中添加1 mL INT和1 mg煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),并在黑暗中(30°C,30分鐘,200 rpm)培養。為了終止反應,向混合物中添加1 mL甲醛。在4000 rpm下離心10分鐘后,使用5 mL薄荷醇從混合物(200 rpm,20分鐘)中提取INF,然后在10000 rpm下離心5分鐘。最后,在490 nm處用分光光度法檢測INF提取物,并根據吸光度(ABS)值計算ETSA,即μgO2·mg?1蛋白質·min?1(Wan等人,2016年)。


用磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、三氯乙酸(TCA)和百草枯(TPP)提取5 g潮濕土壤樣品。提取后立即進行超聲波處理(4°C,2分鐘,200 W)(Martens,2001)。在離心土壤樣品(4°C,20分鐘,13000 rpm)后,提取懸浮液并將其儲存在0°C的塑料瓶中,并使用ATP測試試劑盒(中國江蘇南京建誠科技有限公司)測量ATP濃度。ATP含量也根據ABS值計算為nmol g?1.


2.5 DNA提取和實時定量PCR分析


根據制造商的說明,使用土壤快速DNA®旋轉試劑盒從對照處理和C25 CHT改良處理的5 g土壤樣本中提取土壤DNA。使用NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計(美國Thermo Scientifisher)測定最終DNA濃度和純化,并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA質量。進行實時定量PCR分析以評估細菌16S rRNA總量和反硝化過程中功能基因的豐度,包括硝酸鹽還原(narG)、亞硝酸鹽還原(nirK和nirS)、一氧化氮還原(norB)和氧化亞氮還原(nosZ)(表S2)(Saggar等人,2013)。所有樣品一式三份。功能基因的擴增效率為85-109%,R2值為0.990-0.998。


2.6高通量16S rRNA基因測序和分析


根據標準方案對16S rRNA基因進行高通量Illumina MiSeq測序(Caporaso等人,2012年)。原始fastq文件被解復用,通過Trimmomatic進行質量過濾,并通過短讀?。‵LASH)軟件的快速長度調整進行合并。通過核糖體數據庫項目(RDP)分類器算法對照16S rRNA數據庫分析每個16S rRNA基因序列的分類(http://rdp.cme.msu.edu/)使用80%的置信閾值。


2.7統計方法


所有實驗參數一式三份,數據以平均值±標準差表示。使用單向方差分析(ANOVA)和Tukey t檢驗比較C0、C5、C10和C25處理之間的差異。使用SPSS 19.0版軟件進行數據分析。統計數據在P b 0.05時被認為存在顯著差異。


3、結果和討論


3.1 CHT在土壤中的殘留


如圖1所示,在72小時后測量不同改良處理中的CHT殘留濃度。CHT殘留濃度分別為3.8±3.3、7.7±1.8和22.8±1.4 mg kg?C5、C10和C25處理中分別為1。方差分析顯示,C25處理的CHT濃度在統計學上顯著高于C5(P b 0.01)和C10(P b 0.01)。C10處理的CHT濃度也顯著高于C5處理(P<0.05)。本研究中測得的CHT濃度高于Souza等人(2017)報告的結果,這可能是由于初始土壤應用中的濃度較高?;蛘?,低耗散率也可能導致CHT累積。不同研究中CHT的土壤降解速率差異很大(Singh等人,2002年;Souza等人,2017年)。先前的研究表明,CHT降解與土壤條件密切相關(Van Scoy和Tjeerdema,2014),中性pH值和3-4%的總碳含量等土壤特性有利于CHT的高效降解(王等人,2011)。在本研究中,茶園土壤的低pH值可能是CHT在土壤中低效降解和高積累的原因。

圖1.三種濃度的百菌清(CHT)(5、10和25 mg kg)的殘留?1)施用后72小時在土壤中。誤差條表示三次測試的標準偏差。A*以上數據表明對照組和CHT處理之間存在顯著差異(P b 0.05)。


3.2 CHT對土壤反硝化過程的影響


為了比較對照處理和CHT應用處理中的反硝化過程,研究了NO3的變化?和NO2?本研究確定了72小時試驗期間的濃度以及最終N2O濃度。

圖2百菌清(CHT)對NO3變化的影響?(a),最終編號2?反硝化過程中的濃度(b)和最終N2O生成(c)。誤差條表示三次測試的標準偏差。Tukey t檢驗,與對照組相比,*P b 0.05,**P b 0.01。


如圖2a所示,NO3的最終濃度?在測試的四種處理中,范圍為18.5至54.2 mg N kg?1、與C5、C10和C25處理相比,NO3的83.8%?在對照治療(C0)中被移除。3號?C25處理的去除率顯著下降至54.1%(P<0.01)。NO2的變化?72小時內的濃度如圖S1所示,最終NO2?四種處理的濃度不同(C25≈C10?C5 N C0),范圍為3.5 mg N kg?1(C0)至5.3 mg N kg?1(C25)??紤]到接觸CHT的潛在毒性,較高的NO2?C10(P b 0.01)和C25(P b 0.01)處理中的累積可能是由于CHT對NO3的負面影響?和NO2?還原過程。此前的一項研究也報告了不同殺菌劑(如2-氯-4-苯基苯酚和2-芐基-4-氯酚)對反硝化過程的類似抑制作用(Holzem等人,2014)。結果表明,隨著殺菌劑濃度的增加,反硝化抑制作用增強。然而,郎和蔡(2009)觀察到CHT和多菌靈對反硝化的不同現象。據報道,這兩種殺菌劑在田間添加速率下對反硝化沒有影響,而CHT在濃度為110或220 mg kg時對土壤反硝化略有抑制?1.殺菌劑對土壤反硝化作用的不同影響可能與殺菌劑類型、添加量、培養條件和土壤微生物群落有關。如圖2c所示,對照組中的最終N2O濃度(39μg N kg?1)顯著低于C25處理(76μg N kg)?1)(P b 0.01),比對照組高1倍。這一結果與之前的研究一致,之前的研究報告稱,施用殺菌劑后,N2O排放和積累增加(Yan等人,2015年)。在本研究中,實驗期間土壤NH4+濃度沒有明顯變化(圖S2),表明沒有發生實質性的硝化作用,幾乎所有的N2O都是通過反硝化作用產生的。Kinney等人(2005)報告說,增加CHT施用量會抑制反硝化過程中的N2O生成。這表明CHT可能抑制NO到N2O的還原過程,并減少N2O的生成?;谶@些數據,本研究中C25處理的最終N2O濃度較高可能是由于對N2O消耗過程的抑制作用強于對N2O生產過程的抑制作用。對于N2O的排放,N2O消耗過程(N2O→N2)似乎比其生產過程更重要(否→N2O)(Van den Heuvel等人,2011年)。鑒于此,本研究測定了四種反硝化酶的活性,以評估CHT對反硝化過程每個步驟的影響。