隨著高通量技術的發展,我們對微生物的認識逐步深入,微生物在臨床以及科研上的應用越來越多,而微生物采樣的正確與否直接關系到微生物數據的準確性。因此,微生物的采樣方法就顯得格外重要。

首先,我們需要在取樣的過程中,注意以下幾個方面:


(1)所有實驗用到的取樣用具必須是經過滅菌的(如樣品袋、取樣器、采血管、試管、鏟子、匙、刀類工具等)。


(2)收集樣品信息,取樣前或取樣后應在盛裝樣品的容器或樣品袋上立即貼上標簽,每件樣品必須標記清楚(例如品名、來源、數量、取樣地點、取樣人及取樣日期等)。


(3)請盡量將樣本分裝3-5份備份;建議每組取6個及以上重復較為合適,至少3個重復。


(4)用到谷禾取樣管的實驗樣品,可以常溫運輸;如果不用取樣管,則必須低溫-80℃保存,保存期間切忌反復凍融;低溫寄送時請將樣品置于泡沫箱中,用干冰寄送。


然而樣品種類繁多,不同的樣品取樣有不同的方案,下面詳細介紹每類樣品對應的取樣方案。


環境微生物


普通土壤


(1)去除表面浮土、凋落物等,根據土壤情況,選擇是否過2mm篩網,每個樣品從3個及以上采樣點采集并混合而成,建議將樣本分裝3-5份備份;


注:采樣時需注意每個采樣點的取土深度及采樣量應均勻一致,土樣上層與下層的比例要相同。


(2)保存于無菌離心管中,置于泡沫箱(冰袋或干冰)中,0°C以下運回實驗室;


(3)如果條件不允許立即提DNA,可將樣品置于-80°C冰箱中保存,并通過干冰寄送至公司后提取樣品總DNA。



根際土壤


根際,是指受植物根系活動影響,在物理、化學和生物學性質上不同于土體的那部分微域環境。部分研究是針對土壤微生物與植物之間的相互關系,因此需要對根際土進行取樣。


(1)采集植株,去除根周較松散的土,仍附著在根系表面的視為根際土。將植物置于裝有冰袋或干冰的保溫箱中,避光條件,0℃以下運回實驗室;


(2)準備無菌容器,將植物根系部分置于緩沖液(PBS或生理鹽水)中震蕩,震蕩時間和強度依據樣本實際情況調整,洗下根際土;


(3)將洗滌液進行高速離心,收集土壤沉淀,若沉淀較少,也可過濾膜,同一樣方取樣的樣本進行多點等量混合;


(4)將樣本分裝至離心管中,密封,標記樣本信息后液氮速凍,置于-80℃冰箱保存,干冰寄送。


水體沉積物、底泥


采集水底沉積物5~10 g(具體深度依據實驗目的確定),保存于凍存管中,標記好樣本信息后液氮速凍或置于裝有干冰的泡沫盒中,黑暗環境下,盡快運回實驗室,-80℃冰箱保存,干冰寄送。


活性污泥


多點取樣并等量均勻混合至約10 ml的懸浮污泥樣本(5~10 g沉降物),保存至凍存管中,標記好樣本信息后液氮速凍或置于裝有干冰的泡沫盒中,黑暗環境下,盡快運回實驗室,-80℃冰箱保存,干冰寄送。


水體


(1)采集水樣應注意無菌操作,以防止雜菌混入。


(2)根據實驗設置,選取適當孔徑的濾膜,使用水體抽濾機抽濾1~100 L水體(不同水質間差異極大),或抽濾至濾膜上可見明顯覆蓋物。


對于渾濁水體,建議過濾前靜置分離懸浮顆粒物,先用大孔徑濾膜過濾一遍,再用小孔徑濾膜過濾。


(3)標記好樣本信息后液氮速凍或置于裝有干冰的泡沫盒中,黑暗環境下,盡快運回實驗室,-80℃冰箱保存,干冰寄送。


注:根據水體中微生物含量不同,取樣量有所不同:污水等菌群豐富的水體用量一般為200-1000 ml,湖泊、河流等自然水體一般為1-2 L,自來水等菌群含量較低的水體則一般為1-5 L,海洋水體隨著地理位置、季節和取樣深度浮動較大。


食品


包裝食品


盡可能取原包裝,檢驗前不要開封,以防污染。


大塊冷凍食品,應從幾個不同部位用滅菌工具取樣,使樣品具有充分的代表性;


在將樣品送達實驗室前,要始終保持樣品處于冷凍狀態。樣品一旦融化,不能再凍,保持冷卻即可。


液體食品


通常情況下,液態食品較容易獲得代表性樣品。


盛放在大罐中的液態食品(如牛奶、奶昔、飲料等),取樣時可連續或間歇攪拌;


盛放在小容器的液態食品,可在取樣前將液體上下顛倒,使其完全混勻。較大的樣品要放在已滅菌的容器中送往實驗室。實驗室在取樣檢測之前應將液體再徹底混勻一次。


對于牛奶、葡萄酒、植物油等,常采用虹吸法(或用長形吸管)按不同深度分層取樣,并混勻。如樣品粘稠或含有固體懸浮物或不均勻液體應充分攪勻后,方可取樣。


半固體食品


用無菌操作開啟包裝,此類樣品無法用吸管吸取,可用無菌勺子從不同部位挖取樣品,放入無菌盛樣容器。若樣品是粉末,應邊取邊混合。


固體食品


面粉或奶粉等易于混勻的食品,其成品質量均勻、穩定,可以抽取小樣品(如100g)檢測。但散裝樣品必須從多個點取大樣,且每個樣品都要單獨處理,在檢測前要徹底混勻,并從中取一份樣品進行檢測。


肉類、魚類或類似的食品既要在表皮取樣又要在深層取樣。深層取樣時要小心不要被表面污染,同時避免使之暴露在空氣當中。


有些食品,如鮮肉或熟肉可用滅菌的解剖刀和鉗子取樣;冷凍食品可在未解凍的狀態下可用鋸子、木鉆或電鉆(一般斜角鉆入)等獲取深層樣品;全蛋粉等粉末狀樣品取樣時,可用滅菌的取樣器斜角插入箱底,樣品填滿取樣器后提出箱外,再用滅菌小勺從上、中、下部位取樣。




注:


·注意不要使固體樣品過度潮濕,以防食品中固有的細菌滋生。


·食品如為非冷藏易腐食品,應迅速將所取樣品冷卻至0℃~4℃;若樣品是冷凍的,應保持冷凍狀態,低溫寄送。


植物內生菌


植物內生細菌是植物微生態系統中的重要組成部分,直接對植物組織樣本進行測序分析,可以研究植物內生細菌或真菌的多樣性。


(1)根據研究對象選取新鮮植物組織(如果是植物根部,需去除根表粘附土壤);0℃以下運回實驗室;


(2)根據組織大小剪成小塊或小段(至少兩邊不超過0.5cm),在無菌工作臺內,用無菌水對植物組織進行洗滌30s;


(3)表面無菌化處理:


第一次消毒:75%無水乙醇浸泡1min;第二次消毒:2%次氯酸鈉處理3min,轉入75%無水乙醇浸泡30s,接著用無菌水漂洗3次;


(4)進行核酸提取實驗或液氮速凍,放置-80℃冰箱保存。干冰寄送。


動物腸道內容物


(1)用無菌手術刀挖?。ɑ驘o菌鑷子擠出,也可用無菌生理鹽水沖洗出)腸道內容物;


(2)直接用谷禾取樣盒里的棉簽沾取約黃豆大小的腸道內容物,將沾取內容物的棉簽浸入取樣管液體攪拌洗脫內容物進入取樣管保存液內;攪拌約30-40s,然后丟掉棉簽,將管子蓋子擰好,快速搖晃取樣管至少30秒;


(3)觀察到管內液體帶有明顯腸道內容物顏色即取樣成功,常溫寄送。


人和其它動物糞便


(1)使用前請洗凈雙手,防止雜菌干擾。將取樣管取出,擰開蓋子。


(2)用取樣棉簽沾取少量新鮮糞便(需要量為黃豆一綠豆大小);如糞便較干,可先將棉簽在取樣管中浸濕后沾??;


(3)將沾取糞便的棉簽浸入取樣管液體攪拌洗脫糞便進入取樣管保存液內,攪拌約30-40s,然后丟掉棉拭子,將管子蓋子擰好,快速搖晃取樣管至少30秒;


(4)觀察到管內液體帶有明顯糞便顏色即取樣成功,常溫寄送。




注:


·如3天內使用過抗生素類、質子泵類胃藥、阿片類精神藥物請停藥3天后再檢測。


·感冒、腹瀉或其他癥狀期間不影響取樣,拉稀或稀便可以用棉簽反復沾取糞便至取樣管。


·如長期便秘無排便可使用開塞露等輔助手段獲取糞便樣本。


·取樣無時間和飲食限制,但是取樣前最好正常飲食。


·完成取樣后樣本可常溫有效存儲一周,為保證檢測時效請完成取樣后盡快送回。


口腔


口腔拭子


(1)采樣前30分鐘禁食、禁煙酒等;


(2)準備一杯清水(約150ml),將清水含入口中,充分洗漱口腔約10秒,重復2-3次。


(3)將拭子伸入口腔,使拭子頭充分接觸左側口腔內壁,上下牙床處粘膜,用適當力度上下擦動并旋轉拭子15-20圈。用同樣方法在右側口腔內壁及上下牙床粘膜處進行另一根拭子的采樣。


(4)將拭子置入取樣管保存液內,攪拌約30-40s,然后丟掉拭子,將管子蓋子擰好,快速搖晃取樣管至少30秒;常溫寄送。


咽拭子


(1)采樣前30分鐘禁食、禁煙酒等;


(2)準備一杯清水(約150ml),將清水含入口中,充分洗漱口腔約10秒,重復2-3次。


(3)將采集對象舌頭外拉,使懸雍垂盡可能向外牽引。同時,將拭子越過舌根到咽后壁或者懸雍垂后側,反復擦拭15次以上,避免接觸舌、口腔粘膜和唾液。


(4)將拭子置入取樣管保存液內,攪拌約30-40s,然后丟掉拭子,將管子蓋子擰好,快速搖晃取樣管至少30秒;常溫寄送。


唾液取樣


(1)采樣前30分鐘禁食、禁煙酒等;


(2)準備一杯清水(約150ml),將清水含入口中,充分洗漱口腔約10秒,重復2-3次。


(3)用舌尖抵住上顎或下顎齒根以富集唾液,向取樣管中輕輕吐入唾液,直至液體唾液(非氣泡)達到2ml以上。攪拌約30-40s,快速搖晃取樣管至少30秒;常溫寄送。


牙菌斑取樣


(1)采樣前30分鐘禁食、禁煙酒等;


(2)準備一杯清水(約150ml),將清水含入口中,充分洗漱口腔約10秒,重復2-3次。


(3)用棉卷隔濕所采集的牙齒,再以無菌生理鹽水沖洗牙面,用無菌挖匙或探針采集窩溝菌斑或唇頰面菌斑;以牙線置于兩鄰牙之間,緊貼牙面采集鄰面菌斑。采集后放入含有保存液的取樣管內,攪拌約30-40s,快速搖晃取樣管至少30秒;常溫寄送。


皮膚


一、樣本篩選


如果受試者存在以下情況,則需剔除:


(1)采樣前7天,臉部,頭皮,脖子,胳膊,前臂或者手使用過抗生素或者萜類物質者;


(2)臉部,胸部,背部或者肩膀有痤瘡者;


(3)頭皮,臉,脖子,手臂,前臂或者手上有水泡,膿皰,瘡,膿腫,腐爛或者潰瘍者;


(4)在取樣部位處有一處水泡,膿皰,瘡,膿腫,腐爛,潰瘍,蘚,傷口,裂紋或者色素及粉紅色的皮膚修復區者;


(5)身上有多處粉色或紅色皮膚區域者(暗指牛皮癬或者濕疹患者);


(6)手掌或者腳掌皮膚增厚或者有裂紋者;


(7)兩周之內,每天使用去屑洗發水都不能清理干凈頭皮屑者;


(8)身體一處或者多處有散發型皮疹者。


二、收集方法


(1)將拭子在無菌生理鹽水或清水中浸濕,在實驗目的區域擦拭10s;


(2)樣本采集后立即將拭子置入取樣管保存液內,攪拌約30-40s,然后丟掉拭子,將管子蓋子擰好,快速搖晃取樣管至少30秒;常溫寄送。


人體其它部位


組織


(1)取相應部位組織樣品,于無菌操作臺上解剖,用滅菌剪刀、解剖刀切取指甲蓋大小左右組織塊;


(2)將組織塊放入凍存管中并蓋緊蓋子,標記好樣本信息。樣品液氮速凍后放入-80℃冰箱保存。干冰寄送。


肺泡灌洗液


(1)口咽部進行霧化利多卡因麻醉后,滴注120-300mL無菌生理鹽水進行BAL液體標本的收集。取樣后離心,去掉上清,取沉淀物。


(2)用液氮速凍-80℃保存,干冰寄送;或取沉淀物洗脫置取樣管,攪拌約30-40s,快速搖晃取樣管至少30秒,常溫寄送。


腸道灌洗液


(1)收集腸道灌洗液,過膜;或者將腸道灌洗液離心,棄上清,取沉淀物。


(2)用液氮速凍-80℃保存,干冰寄送;或取沉淀物洗脫置取樣管,攪拌約30-40s,快速搖晃取樣管至少30秒,常溫寄送。


生殖道


(1)采用無菌棉拭子,沿著陰道口、陰道中部和后穹窿內腔壁旋轉拭子做圓周運動數次。


(2)擦拭后立即將拭子浸入取樣管中的保存液中,攪拌約30-40s,快速搖晃取樣管至少30秒,常溫寄送。


血液


(1)成人10-20ml(兒童1-3ml)全血收集到真空采集管(已加入抗凝劑),上下顛倒兩次。


(2)標記信息,低溫保存,干冰寄送。


乳汁


(1)洗凈雙手,母乳期用無菌水擦拭乳頭,取乳汁5-10ml 3管(除掉第一管)。


(2)低溫(-20℃)保存,干冰寄送;或者用拭子沾取乳汁后,立即將拭子浸入取樣管中的保存液中,攪拌約30-40s,快速搖晃取樣管至少30秒,常溫寄送。


腹水


(1)收集腹水10-20ml,離心,棄上清,取沉淀物。


(2)用液氮速凍-80℃保存,干冰寄送;或取沉淀物洗脫置我們的取樣管,攪拌約30-40s,快速搖晃取樣管至少30秒,常溫寄送。


膽汁


(1)膽汁樣本由十二指腸引流法或膽囊穿刺法或手術中留取膽汁,采集膽汁量為5ml,置無菌管內,離心,棄上清,取沉淀物。


(2)用液氮速凍-80℃保存,干冰寄送;或取沉淀物洗脫置我們的取樣管,攪拌約30-40s,快速搖晃取樣管至少30秒,常溫寄送。


尿液


(1)采集中段尿液40 ml左右。(中段尿:在排尿過程中,棄去前、后時段排出的尿液,以無菌容器收集);


(2)一般留取清晨第一次尿液,最好憋尿6小時。住院患者可以直接取晨尿,患者將晨尿的中段尿收集至無菌杯中40 ml為宜;門診患者或健康人等無尿意者,可以適量飲水,在有尿意時盡可能的多憋一段時間,將尿液的中段尿收集至無菌尿杯中40 ml為宜;


(3)離心,去上清,加入我們的液體保存,常溫寄送。


注:


·應在抗生素使用前或停用抗生素藥5天后留尿液標本。


·對于小便輕度失禁患者或者憋尿時間過長患者,對中段尿比較難控制的情況下,我們可以告知患者在排尿過程中3 s后采集尿液。


·如果是病?;蚧杳圆∪?,可由相關醫務人員用導尿方法采集尿液,此操作過程中要嚴格執行無菌操作,避免因導尿不慎而導致的泌尿系統感染。也可以采用經下腹前壁膀胱穿刺取尿培養的方法。


以上是各類樣品的取樣方法,可供參考。


也許有人問,是否一定要用我們的取樣管保存液,能不能用生理鹽水或者別的來替代。下面是我們進行的關于保存液的測試:



經測試,使用谷禾取樣管保存液,能在-80℃~65℃的條件下保持DNA完整性,室溫有效儲存長達30天,盡可能保證與新鮮樣本具有一致的菌群構成特征。


要想得到較為理想的測序結果,首先樣品的質量需要得到保障,當然樣本提取、建庫、分析對最終結果都會產生一定的影響,而取樣同樣重要。如果沒有取好,后續分析再多,可能也得不到想要的結果。


另外,嚴謹的研究設計對于獲得準確且有意義的結果也很重要,研究設計中應注意考慮混雜因素,如果在不確定的情況下,也可以適當咨詢我們的技術顧問,結合我們的經驗,給您合適的建議。


當然實驗過程中,也可能會受到多種因素的影響,我們會采用陰性和陽性對照,盡可能減少這些不必要的影響。


總之,做好前期的準備工作,包括研究設計,取樣等,后續的提取、測序、分析交給我們~


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